壹．收货指南（重要）此指南仅供常规细胞培养参考方法，具体以实际情况而定。

1） 收货前根据说明书培养条件，提前准备细胞培养所需材料以及熟悉相应的培养方法和注意事项。

2） 收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

3） 收货后没有外观损坏的情况下用75%酒精消毒后将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-6小时等待细胞稳定。

4） 细胞稳定后在显微镜下确认细胞生长状态，判断细胞的密度并清晰拍照100倍200倍照片最少2张记录反馈细胞状态以防出现售后作为证据，没有照片和反馈默认接受细胞质量没有问题。

备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。当密度达到80%左右， 传代比例前几次都按照1:2传代，传代后一个倍增周期后可以长成2瓶80%左右密度的细胞时，冻存其中一瓶成1个1ml的冻存管当种子细胞保存，另外一份长满的细胞继续1:2传代，反复操作后冻存细胞种子大约3个以上。 后续根据细胞倍增效率和密度可以适当扩大传代比例做实验。

传代比例：

1个T25瓶传2个6cm的培养皿或者2个T25瓶 相当于1:2   1个T25瓶传1个10cm的培养皿或者1个T75瓶 相当于1:3

贰．售后说明。

1. 1、我们确保收到货的时候没有问题，所以要求收货后拍照作为依据， 也方便在出现售后的时候找到具体原因对症解决问题。
2. 2、收货提供照片确认没有问题后再发现有问题，需要填写售后表格，经由技术和客户双方沟通确定具体原因，由具体原因决定售后解决方案，收货方的责任，一周内我们也承担一半的费用半价重新补发新的活细胞，1周到2周的酌情商议，超过2周的本公司可以不负责售后补发仅提供技术支持。

叁．细胞复苏、传代与冻存操作流程

冻存液：90%FBS或者完全培养基+10%DMSO 或者使用成品正规厂家无血清冻存液均可

冻存发货的细胞  常规常见细胞 冻存管2只（一只为赠送）。我们建议客户先复苏1只，存活的话第二只当种子保存，第一只没有存活再严格按照我们的要求复苏第二只，如果还不成功 第一时间反馈细胞复苏的详细信息给我们。

复苏

1. 将恒温水浴锅中的水预热到37℃；
2. 准备一支15ml离心管，加入5ml含10% FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；
3. 戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；
4. 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000 rpm离心5min；
5. 准备一个T-25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4ml完全培养基；
6. 离心完成后弃去上清，用1ml完全培养基重悬细胞后，转入T-25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。

注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

传代  

贴壁细胞：

1. 当细胞汇合度达到80%-90%时，可进行传代。
2. 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
3. 向培养瓶内加入3ml无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS，对于分泌物比较多的细胞可以重复2-3次。也可以轻轻的冲洗；
4. 向瓶内加入消化液1ml，浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育1~2min（具体以细胞贴壁是否牢固决定时间，当胰酶加入后培养箱内30秒以后细胞开始逐步脱落的过程中可以移出培养箱至显微镜下观察后续细胞变圆脱落情况，当90%细胞都脱落后立马终止消化，剩下的10%左右的细胞可以单独处理完换液继续培养有可能也可以生长起来）；
5. 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若绝大多数消化下来则直接向培养瓶内加入3ml含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15ml离心管；一定要彻底终止消化，以防含有EDTA的胰酶残留，会损伤刺激细胞膜。在以消化下来为前提的情况下，减少胰酶对细胞膜的损伤时间，有助于维持细胞系的状态持续稳定，降低老化速度）
6. 1000rpm离心5min；
7. 准备两个新的T-25培养瓶，各加入4ml完全培养基。
8. 离心完成后，弃上清，用2ml完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1ml；
9. 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。

注意：贴壁细胞的消化过程对于控制细胞的老化最为关键，原则在于达到消化的目的同时减少细胞收到胰酶的刺激时长越短刺激越小。

终止消化的时候如果完全培养基不含有血清则一定要单独配置含有血清的培养基来终止胰酶的消化作用。

1. a)每次消化不超过2min，如果消化2min后，培养瓶中还有较多细胞贴壁，可采用分步消化，将消化下来的细胞移入15mL离心管中和，再向培养瓶中加入胰酶继续消化，每次消化不超过2min，直到完全消化下来为止。
2. b)细胞传代建议1传2，前期传代后冻存一份细胞，另外一份细胞继续扩增，确保细胞种子保留好之后可以扩大传代比例。
3. c)特殊细胞贴壁特别牢固的也可以采用长时间消化法或者物理细胞铲（刮）把细胞消化或者刮下来，比如巨噬类细胞。
4. d)有一些细胞属于半贴壁生长，收货后一部分贴壁，还有一部分悬浮的情况下，注意不要把悬浮的细胞全部抽掉不要，或许还是活细胞，应该根据密度数量情况决定是否需要收集起来和贴壁一重新铺瓶。

悬浮细胞：悬浮细胞尤其是很多血液类相关细胞比较容易受环境运输影响出现更多比例的死细胞，收货后尽快收集全部细胞重新铺瓶，可以采用T25瓶竖着培养5ml完全培养基降低培养基容量提高初始密度尽量高一点，该换液的时候进行补液2-3ml进去的方式减少细胞丢失，避免反复离心。

冻存（细胞冻存建议每瓶T25冻一支）

1. 1)将需要那冻存的细胞从CO2培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；
2. 2)向培养内加入无菌1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；
3. 3)重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液2ml，轻微震荡后放入37℃ CO2培养箱中孵育1min左右；
4. 4)孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞未消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；
5. 5)向消化下细胞的培养瓶中加入3ml含10%血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；
6. 6)离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8ml冻存管中；
7. 7)将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
8. 8)第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。