酶联免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以简单地测出样本中有多少蛋白质、多肽、抗体，是实验室比较常用的一种检测方法。而这种简单的分析方法的核心，就是标准曲线。没有它，我们的实验就变成了一个二元的“是/不是”测试。有了它，我们可以深入研究生物反应的细节。

有多少人对ELISA标准曲线拟合头痛？！今天将以二次曲线回归为例，讲解如何使用ELISAcalc软件绘制标准曲线，具体实验请选择合适的拟合方式（以回归系数最接近1.0为准）

第一步：打开软件ELISACalc，界面如下：
（点击下载软件 ELISACalc.zip）

第二步：输入数据：

① 标准品有S1 , S2 , S3 , S4 , S5 , S6 , S7 ,7个浓度。（0孔也就是Blank值不用输入）

②“X”代表浓度/剂量，“Y”代表OD/反应值。在运行软件的X、Y列中，依次输入相对应的值，如下图所示：

第三步：回归/拟合 模型（M），下拉选择二次曲线回归，X数据列下拉选择对数（10为底），Y数据列下拉选择对数（10为底），如下图所示：

第四步：点击“回归/拟合”，显示标曲。

第五步：点击“回归方程”，可以得到二次曲线回归方程以及r2值等。（同一个试剂盒可以用多种方式进行拟合，例如：四参数、直线。最终根据r2值大小判断曲线的拟合程度，越接近1，拟合程度越好。）

第六步：标准曲线已知，并且“X”浓度/剂量 和“Y”OD/反应值是已知的。根据标准曲线求浓度，也就是“由Y计算X”，来计算样本浓度。在空格中输入样品的OD值，回车或点击“计算"，即能计算对应的浓度。（点击“复制”按钮可以将结果全部复制下来，粘贴到EXCEL表格中进行下一步做图分析。）

数据处理需注意的问题：

1、二次曲线计算的结果会有两个解，要舍掉其中一个偏离度大的。

2、Log-logit的拟合方法是用于竞争法的，竞争法也可以用四参数或五参数的方式进行拟合。

3、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。

4、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。

5、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，ELISA试剂盒这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

6、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。

7、标准曲线的样品数一般为7个点，但至少要保证有5个点。

8、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数R至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999。

要想绘制出合格的标准曲线、使用好标准曲线，真心不易，必须将各个方面的条件都考虑进去，即对标准曲线的绘制也实行质量控制，只有这样, 才能得出理想的标准曲线。